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布魯氏桿菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)！布氏桿菌病是一種由布魯氏菌引起的人獸共患動(dòng)物源性*性傳染病，它是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的B類(lèi)動(dòng)物疫病，我國(guó)也將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病之首。該病不僅阻礙我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，同時(shí)對(duì)人體健康產(chǎn)生重大影響，21世紀(jì)由于畜間布病的影響，我國(guó)人間布病的發(fā)病率有所提高，國(guó)家適時(shí)出臺(tái)了《畜間布魯氏菌病防控五年行動(dòng)方案（2022—2026年）》，確定了到2026年，我國(guó)牧場(chǎng)個(gè)體陽(yáng)性率控制在0.4%以下，群體陽(yáng)性率控制在7%以下的總體目標(biāo)。為達(dá)成目標(biāo)離不開(kāi)檢測(cè)技術(shù)的支持，現(xiàn)階段布病的檢測(cè)方法較多：如虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。但虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）還是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)手段。
一、布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗(yàn) （RBPT）的優(yōu)勢(shì)及原理 1、當(dāng)前布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)虎紅平板凝集試驗(yàn)）仍然是我國(guó)布病診斷使用頻率*、最主要的檢測(cè)方法，是我國(guó)法定的檢測(cè)方法，在國(guó)際貿(mào)易中也是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測(cè)的指定試驗(yàn)，該檢測(cè)方法具有試驗(yàn)試劑成本低廉、操作簡(jiǎn)便、快速、檢出率高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于布病的大規(guī)模篩查、引種、及疫苗免疫效果評(píng)價(jià)等。由于本方法不需要特殊的試驗(yàn)設(shè)備，更適于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)后，養(yǎng)殖戶也可自行完成檢測(cè)。為布病的防控及凈化提供了強(qiáng)有力的檢測(cè)手段。 2、虎紅平板凝集試驗(yàn)又稱(chēng)為班氏孟加拉紅平板凝集試驗(yàn)。由于所用的抗原是酸性(PH3.6-3.7)帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的lgM類(lèi)抗體的凝集活性、檢查的抗體是lgG類(lèi)，因此提高了反應(yīng)的特異性。 二、試驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1、由賽諾利康生物技術(shù)（北京）有限公司生產(chǎn)的虎紅平板凝集抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清。陰性和陽(yáng)性血清為凍干品，使用時(shí)按標(biāo)明的毫升數(shù)用0.5%苯酚（俗稱(chēng)石炭酸）生理鹽水進(jìn)行稀釋備用。 2、采血應(yīng)規(guī)范、自然出清、且勿添加抗凝血?jiǎng)�，被檢血清應(yīng)新鮮，無(wú)明顯蛋白凝塊，無(wú)溶血和無(wú)腐敗氣味。 3、潔凈玻璃板，其上劃分成4c㎡小格并做好與家畜相應(yīng)的標(biāo)號(hào)或者使用凝集試驗(yàn)板。 4、吸管或移液器，適于滴加30μL（0.03mL）液體。移液器的規(guī)格*為5-50μL，確保劑量的準(zhǔn)確。 5、準(zhǔn)備牙簽供攪拌用，確保每個(gè)樣本都使用單獨(dú)牙簽。 6、稱(chēng)取0.5克苯酚（俗稱(chēng)石炭酸），加入100ml的生理鹽水中，配置后高壓鍋中121℃高壓30分鐘。 三、操作方法 1、實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)將抗原在室溫放置30-60min。 2、將玻璃板上各方格標(biāo)記被檢血清號(hào)，然后加相應(yīng)被檢血清30μL（0.03mL）。 3、在被檢血清旁滴加虎紅平板凝集抗原30μL（0.03mL）。 4、用牙簽類(lèi)小棒攪動(dòng)血清和抗原，使之充分混合，在4分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，確保每個(gè)樣本血清使用單獨(dú)的牙簽。 5、每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性血清、陽(yáng)性血清對(duì)照。 四、結(jié)果判定 1、在陰、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。 2、受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性(+)，無(wú)凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。一定注意超過(guò)4min沒(méi)有判定意義。 3、在觀察時(shí)可將玻璃板或凝集板進(jìn)行搖動(dòng)使混合液流動(dòng)，更利于結(jié)果的觀察。 4、如下圖1號(hào)為陰性，2號(hào)為陽(yáng)性。如家畜未接種布病疫苗，則陽(yáng)性者為感染布氏桿菌病。
五、注意事項(xiàng) 1、血清的質(zhì)量是影響布病血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一，血清*是新鮮、清亮透明、無(wú)溶血、防止*污染，并且避免反復(fù)凍融。為使檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確*使血液自然出清，自然出清優(yōu)于使用離心機(jī)�？蓽p少纖維蛋白原與虎紅抗原產(chǎn)生非特異性凝集反應(yīng)。 2、抗原在室溫放置30min-60min進(jìn)行回溫，利于抗原與抗體的結(jié)合。 3、在早晨喂料前或停食后6小時(shí)進(jìn)行采血，空腹血清出現(xiàn)假陽(yáng)性少。采集血液樣本時(shí)不要加抗凝劑，以免影響對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出正確的判定。 4、本試驗(yàn)溫度在室溫22±4℃進(jìn)行結(jié)果更加準(zhǔn)確，一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的越快。因此，在試驗(yàn)前要注意環(huán)境溫度是否適合進(jìn)行本試驗(yàn)。 5、凡是試驗(yàn)中凝集顆粒不規(guī)則，大小不勻，片狀或絮狀，凝集不清澈者，一般為假陽(yáng)性，否則凝集顆粒規(guī)則大小均勻，凝集清澈者為陽(yáng)性。 6、抗原的質(zhì)量是影響布病血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵性因素之一，一定要采購(gòu)正規(guī)廠家、產(chǎn)品穩(wěn)定、經(jīng)國(guó)家認(rèn)可的產(chǎn)品。運(yùn)輸過(guò)程中要2-8℃冷鏈運(yùn)輸，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。 7、對(duì)于未操作過(guò)該試驗(yàn)的人員，每次進(jìn)行檢測(cè)的樣本數(shù)量不宜超過(guò)5個(gè)，并且抗原*統(tǒng)一加到血清旁，最后分別用牙簽進(jìn)行混勻。 |
