非洲豬瘟（ASF）是一種發(fā)病率和死亡率都很高的急性和嚴(yán)重傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。由于變異毒株的存在，血清抗體的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)以及病原體檢測(cè)在非洲豬瘟的診斷和監(jiān)測(cè)中具有同樣重要的作用。本指南旨在指導(dǎo)和規(guī)范非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。
1、 豬血取樣要求
1.日常監(jiān)測(cè)：不少于30個(gè)大型養(yǎng)豬場(chǎng)（存欄生豬2000頭以上）；不少于20個(gè)中型養(yǎng)豬場(chǎng)（500-2000頭生豬存欄）；不少于10個(gè)小型養(yǎng)豬場(chǎng)（存欄生豬少于500頭）。
2.應(yīng)急檢測(cè)：根據(jù)實(shí)際需要確定樣本數(shù)量。
2、 樣品制備
非洲豬瘟抗體的檢測(cè)樣本為豬血清或豬血漿。盡量使用新鮮采集的血清或血漿樣本。試樣可在2-8℃下保存5天，需要轉(zhuǎn)移至-20℃或更低溫度的環(huán)境中長(zhǎng)期保存。嚴(yán)重污染或嚴(yán)重溶血的樣品不能用于檢測(cè)；如果血清或血漿樣品混濁，離心后應(yīng)取上清液進(jìn)行檢測(cè)。
3、 儀器和設(shè)備
微量移液管（12通道或8通道可調(diào)移液管，單通道可調(diào)吸液管）和吸頭，恒溫培養(yǎng)箱，ELISA洗板器（可使用移液管手動(dòng)洗板），酶標(biāo)記，樣品稀釋板。
4、 試驗(yàn)方法
非洲豬瘟病毒抗體的檢測(cè)方法主要包括非洲豬瘟間接ELISA抗體檢測(cè)和非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測(cè)。這兩種方法都可用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的抗體。
5、 操作程序
（1） 非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法（以非洲豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為例）
1.主要部件
包括非洲豬瘟病毒抗原包被板、樣品稀釋劑、10倍洗滌液（使用前用超純水稀釋10倍）、ASFV-HRP標(biāo)記抗體、TMB底物溶液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、樣品稀釋劑板和封板膜。
2.操作步驟
（1） 取出所有部件，在室溫（25±3℃）下放置至少60分鐘，然后恢復(fù)至室溫。
（2） 將樣品稀釋50倍。向稀釋板的每個(gè)孔中加入245uL樣品稀釋劑，向每個(gè)孔中添加5uL血清或血漿樣品，并充分混合。禁止稀釋陽(yáng)性對(duì)照血清（PC）和陰性對(duì)照血清（NC）。
（3） 將100uL稀釋樣品加入抗原包被板的孔中。
（4） 向指定孔中加入100uL未稀釋的陰性對(duì)照血清（NC）和陽(yáng)性對(duì)照血清（PC）。
（5） 蓋上密封膜，在室溫（25±3℃）下孵育30分鐘（±2分鐘）。
（6） 使用ELISA洗板器或微量移液器清洗板。丟棄孔中的液體，向每個(gè)孔中加入300uL的一次洗滌溶液，并洗滌三次。最后一次洗滌后，將抗原涂層板輕輕地拍在吸水紙上晾干。嚴(yán)禁在每個(gè)步驟之間干燥孔板。
（7） 向每個(gè)孔中加入100uL ASFV-HRP標(biāo)記的抗體。
注：從瓶中倒出的HRP標(biāo)記抗體不得再次放入瓶中，以防止HRP酶被污染并降低其活性。
（8） 蓋上密封膜，在室溫（25±3℃）下孵育30分鐘（±2分鐘）。
（9） 重復(fù)步驟（6）。
（10） 向每個(gè)孔中加入100uL TMB基板溶液。
（11） 在室溫（25±3℃）下培養(yǎng)15分鐘（±1分鐘）。
（12） 向每個(gè)孔中加入50uL終止溶液以終止酶促反應(yīng)。
（13） 在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。
（14） 結(jié)果判斷和計(jì)算。
3.確定
（1） 實(shí)驗(yàn)建立條件
陽(yáng)性對(duì)照組OD450nm平均值>0.8；
陰性對(duì)照中OD450nm的平均值小于0.2；
如果測(cè)試結(jié)果不在規(guī)定范圍內(nèi)，則應(yīng)再次進(jìn)行測(cè)試。
（2） 計(jì)算方法
陽(yáng)性對(duì)照（PC）OD平均值=（PC1+PC2）/2
陰性對(duì)照（NC）OD平均值=（NC1+NC2）/2