小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants, PPR）俗稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊和綿羊，偶爾感染牛、水牛和駱駝，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。該病是OIE法定報(bào)告動(dòng)物疫病，也是全球計(jì)劃根除的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。
一、診斷標(biāo)準(zhǔn)（現(xiàn)行）表1 小反芻獸疫診斷標(biāo)準(zhǔn)（現(xiàn)行）
1．突然發(fā)熱，第2~3天體溫達(dá)40~42 ℃高峰。發(fā)熱持續(xù)3d左右，病羊死亡多集中在發(fā)熱后期。
2．眼、鼻大量排出分泌物，最初水樣的眼、分泌物日益增多變成膿性然后結(jié)干，動(dòng)物發(fā)出惡臭。由于鼻孔被凸起的結(jié)干的鱗屑覆蓋，動(dòng)物打噴嚏和咳嗽。呼吸急促，呼吸困難，排痰性咳嗽和眼睛的卡他性分泌物。3．口腔粘膜充血，口腔上皮和鼻腔粘膜出現(xiàn)大量部分粘連的極微小的略灰色壞死點(diǎn)，壞死組織脫落后形成界線分明的淺糜爛斑。上皮破損偏好部位為嘴唇、齒齦、牙板、舌頭以及母羊陰戶的陰唇表面。口腔破損可能伴有大量流涎。4．發(fā)熱2~3 d后病畜開(kāi)始腹瀉，伴隨嚴(yán)重脫水、消瘦、虛脫。懷孕母羊可發(fā)生流產(chǎn)。5．特急性病例在發(fā)熱開(kāi)始的4~6 d內(nèi)死亡。亞臨床型病例癥狀較輕，病畜在生病10 ~14d以后康復(fù)。1．嘴唇充血，口腔破損程度不等，較輕的只有一處潰瘍，嚴(yán)重的出現(xiàn)廣泛的潰瘍性及壞死性口腔炎，涉及牙板、硬腭、頰粘膜、乳突和舌頭喙部背面。粘膜病變可延伸至咽部，偶爾在網(wǎng)胃和瘤胃交界處。2．上呼吸道粘膜可能嚴(yán)重充血，伴有鼻孔和氣管的潰瘍。支氣管肺炎，肺尖肺炎。皺胃粘膜出現(xiàn)嚴(yán)重的充血和潰爛。偶爾，整個(gè)腸道出現(xiàn)彌散性的充血，但是，多數(shù)情況僅局限于十二指腸、回腸、盲腸和結(jié)腸上部分。常見(jiàn)回盲腸瓣膜出血。大腸縱向折疊頂部偶爾出現(xiàn)嚴(yán)重的出血形成斑馬樣條紋。3．腸淋巴組織壞死、萎陷。腸系膜淋巴組織輕微腫大、水腫，脾可能腫脹。上呼吸道粘膜可能嚴(yán)重充血，伴有鼻孔和氣管的潰瘍。支氣管肺炎，肺尖肺炎。肺部淋巴結(jié)腫脹并水腫。4．結(jié)膜出現(xiàn)膿性結(jié)膜炎。腎和膀胱可見(jiàn)充血。母羊可見(jiàn)陰戶和陰道糜爛。5．組織學(xué)上可見(jiàn)肺部組織出現(xiàn)多核巨細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)嗜酸性包含體。
備注：“+”表示可出現(xiàn)，“—”表示一般無(wú)病變。表3 小反芻獸疫診斷標(biāo)準(zhǔn)中的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法
每個(gè)發(fā)病羊群最少選擇5只病畜采集樣品。
(1) 選擇處于發(fā)熱期（體溫40~41℃）、排出水樣眼分泌物、出現(xiàn)口腔潰瘍、無(wú)腹瀉癥狀的活畜采集樣品。采集結(jié)膜棉拭子2個(gè)、鼻粘膜棉拭子2個(gè)、頰部粘膜棉拭子1個(gè)。(2) 無(wú)菌采集血液10mL，用常規(guī)方法分離血清。(3) 選擇剛被撲殺或者死亡時(shí)間不超過(guò)24h的病畜采集組織樣品。無(wú)菌采集腸系膜和支氣管淋巴結(jié)各3~4個(gè)，脾、胸腺、腸粘膜和肺等組織各約25~50g。處理棉拭子、組織樣品或肉制品，接種Vero細(xì)胞，在37℃含5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后5d內(nèi)，細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞融合，形成多核體。如接種5~6d后不出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物盲傳三代。將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，使用RT-PCR 方法和熒光定量 RT-PCR方法做進(jìn)一步鑒定。樣品出現(xiàn)細(xì)胞病變，而且RT-PCR方法或?qū)崟r(shí)熒光RT-PCR方法鑒定結(jié)果為陽(yáng)性，則判為小反芻獸疫病毒分離陽(yáng)性，否則判為陰性。可以采用針對(duì)N基因的引物對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)，引物的靶基因、位置、序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小見(jiàn)表4。表4 用于小反芻獸疫病毒RT-PCR檢測(cè)的引物
針對(duì)小反芻獸疫病毒N基因保守序列區(qū)段設(shè)計(jì)引物和探針，引物和探針的位置和序列見(jiàn)表5。表5 用于小反芻獸疫病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的引物和探針
中間孔加陽(yáng)性抗血清，周邊3個(gè)孔加陽(yáng)性抗原，1個(gè)孔加陰性抗原，另2個(gè)孔加待檢抗原，待檢抗原、陰性抗原和陽(yáng)性抗原交替排列。對(duì)流免疫電泳是檢測(cè)病毒抗原的最快速的方法。水平電泳槽的兩個(gè)部分由一個(gè)橋連接，電泳儀連接到一個(gè)高壓電源。1%~2%（w/v）瓊脂或瓊脂糖溶解在0.025M醋酸巴比妥緩沖液中，將凝膠分散在載玻片上，凝膠上打6~9對(duì)孔。每對(duì)孔加反應(yīng)物，血清在正極，抗原在負(fù)極。將載玻片置于連接橋上，兩端由濕濾紙與緩沖液相連接。電泳30~ 60min后，在強(qiáng)光下觀察，每對(duì)孔間出現(xiàn)1~3條沉淀線的為陽(yáng)性反應(yīng)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)反應(yīng)。免疫捕獲ELISA采用幾種抗小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體包被ELISA板，以生物素標(biāo)記的小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，以酶標(biāo)記親和素為顯色劑，檢查被檢樣品中存在的小反芻獸疫病毒；也可采用抗小反芻獸疫病毒多克隆抗體作為捕獲抗體包被ELISA板，以酶標(biāo)記抗小反芻獸疫病毒N蛋白單克隆抗體作為檢測(cè)抗體和顯色劑，檢查被檢樣品中存在的小反芻獸疫病毒。該方法的特異性好，可用于小反芻獸疫和牛瘟的病原學(xué)鑒別診斷，還可用于疫苗生產(chǎn)質(zhì)量的監(jiān)控。但成本太高。PCR-ELISA通過(guò)ELISA，使用標(biāo)記的探針在一塊板上進(jìn)行檢測(cè)。小反芻獸疫病毒的PCR-ELISA是種高靈敏度的基于小反芻獸疫病毒N基因的檢測(cè)方法。這種方法的靈敏度與傳統(tǒng)的RT-PCR相比高10倍。臨床試驗(yàn)中，比免疫捕獲ELISA更適于檢測(cè)早期感染的病毒。同時(shí)能夠有效區(qū)分小反芻獸疫病毒與牛瘟病毒。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)包括競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA。具有快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為小反芻獸疫血清學(xué)檢測(cè)的*方法。競(jìng)爭(zhēng)ELISA是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織認(rèn)可的小反芻獸疫血清學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA已有商品化試劑盒，一種包被抗原是桿狀病毒表達(dá)的重組N蛋白，競(jìng)爭(zhēng)單抗是抗小反芻獸疫病毒N蛋白單抗；還有一種的包被抗原為純化的全病毒，競(jìng)爭(zhēng)單抗為抗小反芻獸疫病毒H蛋白單抗。間接ELISA以重組小反芻獸疫N蛋白為檢測(cè)抗原的間接ELISA試劑盒，和競(jìng)爭(zhēng)ELISA具有良好的符合率，但不能區(qū)分牛瘟病毒和小反芻獸疫病毒產(chǎn)生的抗體。由于我國(guó)已消滅牛瘟，間接ELISA適合我國(guó)小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查。中心孔加抗原，1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；2、4、6孔加被檢血清。每個(gè)平皿設(shè)一組對(duì)照，即1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，2、4、6孔加陰性血清。加樣后靜置10min，移入濕盒內(nèi)于室溫（22~25℃）反應(yīng)。將膠體金標(biāo)記的SPG（鏈球菌G蛋白）固定于金標(biāo)墊，檢測(cè)線為純化的PPRV N蛋白,對(duì)照線為兔抗SPG。檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性樣品中的抗PPRV抗體與膠體金標(biāo)記SPG特早性地結(jié)合，在NC膜上移動(dòng)時(shí)，被檢測(cè)線上的PPRV N蛋白捕獲，膠體金顆粒聚集于此，形成紅色的條帶，即檢測(cè)線。相反，陰性樣品中不含抗PPRV抗體，在檢測(cè)線處不形成紅色條帶。對(duì)照線試劑兔抗SPG與膠體金標(biāo)記SPG結(jié)合，捕獲金標(biāo)復(fù)合物，形成對(duì)照線。（一）《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃（2016—2020年）》
免疫動(dòng)物群體以病原學(xué)監(jiān)測(cè)為主，非免疫動(dòng)物群體以血清學(xué)監(jiān)測(cè)為主。對(duì)病原學(xué)陽(yáng)性動(dòng)物及同群動(dòng)物進(jìn)行撲殺和無(wú)害化處理，并做好追溯排查等防控工作；對(duì)血清學(xué)陽(yáng)性的非免疫動(dòng)物進(jìn)行撲殺和無(wú)害化處理，對(duì)同群動(dòng)物進(jìn)行全面排查，并隔離觀察至少21天，在隔離期內(nèi)每周開(kāi)展檢測(cè)。省級(jí)和地市級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)以病原學(xué)監(jiān)測(cè)為主，縣級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)以血清學(xué)監(jiān)測(cè)為主。各地動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)匦》雌c獸疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估狀況開(kāi)展產(chǎn)地檢疫。（二）《2019年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》——小反芻獸疫監(jiān)測(cè)計(jì)劃對(duì)31個(gè)省（自治區(qū)、直轄市）和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)的山羊、綿羊、野羊于春季（4~5月份）、秋季（10~11月份）各開(kāi)展一次免疫抗體集中監(jiān)測(cè)，各省制定年度監(jiān)測(cè)方案做好常規(guī)監(jiān)測(cè)�？贵w檢測(cè)使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA和阻斷ELISA方法。病原檢測(cè)采集拭子或者組織樣品，采用RT-PCR或者實(shí)時(shí)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。
